产品介绍：

BrdU 作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C 原子连接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA 中。当细胞处于DNA 合成期（S 期）,在培养基中加入BrdU,其就会掺入新合成的DNA中，这种BrdU 就在胞核的DNA 中长期存留；再通过HRP标记的BrdU单克隆抗体，就可以通过TMB底物显色检测细胞增殖和活力情况。这种方法的缺点是；实验步骤繁琐，并且在加入抗体之前，要充分变性DNA，才能使BrdU单克隆抗体顺利结合到掺入BrdU的DNA上，同时破环了其DNA双链结构，影响其他染料的结合。如果变性不充分，实验很容易失败。

本试剂盒所用的核酸类似物为EdU,其掺入新合成DNA的原理和过程BrdU相同；EdU的集团上还有一个炔基团，与下游的荧光染料上的叠氮基团，在一价铜离子催化下，发生Click chemistry反应，也就是大家翻译成中文的点击化学。本方法与BrdU相比的主要优势是操作的流程更简单，并且EdU分子只有抗体分子的1/500，不需要DNA的变性步骤；从效果上来说，EdU比BrdU有更好的灵敏度和准确度。

注意事项：

荧光试剂很容易淬灭，因此实验过程中尽可能选择早期时间观察记录结果，同时注意避光，以减缓淬灭；

为了您的安全，实验过程中请注意佩戴手套。

其他需要自备试剂材料：

• 1×PBS（pH 7.2-7.6）

• 细胞固定液（含 3.7%甲醛的 PBS）

• 细胞透膜液（含 0.5% Triton® X-100 的 PBS）

•    1×Hoechst 33342 染色液

• 含 3% BSA 的 PBS（pH 7.4）

• 去离子水

• 18×18 mm 盖玻片

各种规格吸头及移液细胞培养耗材。

试剂盒储存：

2-8°C,避光，干燥，不要冻存。。

试剂盒操作流程图：

细胞爬片制备（细胞铺板培养）→细胞处理（可选）→EdU与细胞共培养→细胞固定及细胞膜透化处理→检测EdU（click chemistry）→抗体或者其他染料染色→图像捕获及分析

具体使用操作方法：

1.   EdU的标记

正式实验前，最好做预实验，以确定最佳的标记浓度,因为细胞类型，细胞密度，细胞培养基及培养条件不同，最佳包被浓度也不尽相同。预实验的时候，建议从10uM的浓度做几个浓度的梯度来确定最佳使用浓度。

1.1将洗净灭菌的盖玻片放入细胞培养板孔，将合适浓度的细胞铺到盖玻片上，待细胞贴壁及正常生长到合适的密度；

1.2 将EdU溶液用培养基稀释到20 μM EdU 初始浓度，使用的时候，加入与细胞培养液相同体积的以上工作液；例如实验时，细胞培养液为200ul,吸去100ul培养液，然后加入100ul EdU溶液即可；

1.3细胞重新放入培养箱培养，培养的时间长度和培养条件是根据细胞类型确定的，确切的说就是根据细胞生长速度和周期确定的。

以下信息仅供参考：人胚胎细胞细胞周期约30分钟，EdU培养 5-10分钟；人的神经细胞周期是5天，EdU培养 24小时；人的其他细胞一般生长周期20小时左右，EdU培养 2小时左右。

2.   细胞固定及膜透化处理

吸干细胞培养液，将含有细胞爬片的板孔内加入1ml细胞固定液（含3.7%甲醛的PBS）室温固定细胞15分钟

吸干细胞固定液，每孔用1ml洗涤液(含3% BSA的PBS)浸泡5分钟；

吸干细胞清洗液，每孔加入1ml细胞膜透化液（含0.5%的TritonX-100）,室温进行膜透化处理20分钟。

3.   EdU的检测

3.1 10XEdU检测液的配制，将试剂EdU管内加入1ml去离子水，即为10XEdU检测液，使用后及时存放在-20℃，可以稳定保存1年。

3.2 EdU检测工作液配制：用去离子水将10XEdU检测液稀释10倍，即为EdU检测工作液（比如，需要1mlEdU检测工作液,取10XEdU检测液100ul,加入900ul去离子水，混匀即可），现配现用，不可储存备用。

3.3 EdU检测反应体系配置，参照下表配制，现配现用，存储不超过20分钟。

EdU检测反应体系参考表(各组分体积单位：ul)

试剂组分

盖玻片数量

5

10

Reaction Buffer

430

860

CuSO4

20

40

Flour azide

1.5

3

EdU检测工作液

50

100

总体积

500

1000

3.4  配制EdU检测反应体系的同时，立即吸干细胞膜透化液，每孔加入1ml含3% BSA的PBS浸泡清洗5分钟，重复一次；

3.5 吸干清洗液，每孔加入100ul EdU检测反应液，

3.6 室温避光反应30分钟

3.7吸干EdU检测反应液，入1ml含3% BSA的PBS浸泡清洗5分钟，重复1-2次。

某些细胞贴壁能力较强，背景会偏高，可以使用甲醇清洗1-2次，再用含3% BSA的PBS浸泡清洗5分钟，重复1-2次。

4.   染色细胞核（如果需要）

推荐选用 1×Hoechst 33342进行DNA染色

染色的步骤如下：

4.1 每孔加入 1 ml PBS 浸泡清洗细胞，吸干细胞清洗液。

4.2 配制1×Hoechst 33342 染色液。

4.3 每孔加入 200 μl 1×Hoechst 33342 染色液。室温孵育 15 分钟，注意避光。吸干 Hoechst 33342 染色液。

4.4 每孔加入 1 ml PBS 浸泡清洗细胞 5 分钟，重复一次。吸干PBS。

5.   5. 成像及分析

将细胞爬片晾干，封片，选择合适的波长在荧光显微镜下观察并记录图像。