免疫组织化学试剂盒组成及操作规程
一、实验原理与意义 免疫组织化学是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定。借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材 微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制
1. PBS干粉( 2 袋)：每袋加1000ml蒸馏水溶解后为0.01 M PBS pH 7.2-7.4
2. 柠檬酸盐干粉（ 1 袋）：每袋加1000ml蒸馏水溶解后0.01 M柠檬酸缓冲液 PH6.0
3. 30%H2O2： 70 ml
4. 封闭血清工作液： 11 ml 10%山羊血清
5. 抗体稀释液: 30 ml
6. HRP-二抗： 0.5 ml
7. DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
8. 苏木精染液：①用蒸馏水50ml加热溶解硫酸铝钾干粉3.75g；②用无水乙醇2.5ml溶解木精干粉后倒入溶液①中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化*干粉0.125g，继续加热至溶液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每50ml加冰醋酸2.5ml。
9. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）：为实验室常用试剂，本试剂盒不提供。
四、操作步骤
1、脱蜡、水化
1) 60 ℃×60 min→Xylene（1） 10 minutes；
2) Xylene（2） 10 minutes；
3) 100% absolute ethanol（1）：5 minutes；
4) 100% absolute ethanol（2）：5 minutes；
5) 95% ethanol 2 minutes；
6) 70% ethanol 2 minutes；
7) distilled water:5 min；
8) PBS洗2次×3 min。
2、封闭内源性过氧化物酶
9) 用3％H2O2（用蒸馏水10倍稀释即为3% H2O2）RT避光浸润切片30 min。
10) PBS溶液洗3次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
11) 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约4 min×4次，每次间隔1min，补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
12) PBS溶液洗3次×3 min；
13) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入10%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30min；
5、一抗孵育
14) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗100ul，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
15) 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
16) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗100ul放入37 ℃恒温烤箱中30 min。
17) 用PBS洗2次×10 min；
7、显色
18) 加入DAB（快速滴入，观察染**况，倒掉染液），显色时间控制在约2 min，由镜下观察颜色控制时间。
8、复染、脱水、透明、封片
19) 用PBS 3次×3min后，用双蒸水洗5 min；
20) 加一大滴苏木素染液，染10min，用1%盐酸酒精溶液分化20s后，用1%氢氧化氨溶液反蓝2min，双蒸水洗5 min。
21) 脱水： 50% ethanol 2 min，
70% ethanol 2 min
95% ethanol 2 min；
95% ethanol 2 min；
100% absolute ethanol（1）: 2min；
100% absolute ethanol（2）: 2min。
22) 透明：Xylene 1×2 min→Xylene 2×2 min
23) 封片：中性树胶。
五、注意事项
1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。
2. DAB显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。
3. 抗体浓度需要摸索。一抗孵育最好在4度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液但要防止干片。