人Oct-4过表达载体构建

摘要：以人cDNA为模板扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基
因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究，而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞，
也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。
关键词：Oct-4，过表达，EGFP-3FLAG， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理
PCR扩增Oct-4基因序列，构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点，目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下：

二、 实验目的
构建既可用于瞬时转染又可用于慢病毒包装和稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体。

三、 实验方法
PCR扩增的Oct-4基因序列与经EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下：
1. 引物设计：
从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用Vector NTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的基因：
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：

         
2. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：
目的基因PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过和DNA Marker的对比，判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段：
把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中：
将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：

     
 混匀后在42℃孵育30min，然后转移到冰上。静置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。

6. 感受态细胞的制备和转化：
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》¬。¬
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl作为模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

    
 8. 阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. PCR扩增目的基因：
用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT（含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC（引物说明：含同源重组序列、EcoR I酶切位点，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人cDNA进行扩增，预期PCR产物大小为1126 bp，电泳结果如下：
                                                1    2               3     4

1． PCR产物
2． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
2. 表达载体的线性化：
用EcoR I对表达载体进行双酶切，胶回收4801bp的载体片段，酶切图谱如下：
                                                    1     2

                                                 
 1． 载体片段
2． 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中，反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列，阳性克隆得到1287bp的片段，空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下：
                                                 1   2    3    4    5   6   7    8    9   10  11

                                              
 1． 阴性对照（ddH2O）
2． 阴性对照（空载体）
3． DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子
接种阳性克隆，保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的，抽提质粒。

4. 测序结果分析
阳性克隆测序结果表明，和预期序列完全一致。

         
 五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社