焦磷酸甲基化测序
产品名称： 焦磷酸甲基化测序
英文名称： Pyrosequencing
产品编号：
产品价格： 1
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简介
焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。佰臻生物拥有QIAGEN公司最新的PyroMark Q24焦磷酸测序仪（图2-37），采用成熟的焦磷酸测序技术，是集测序、样品制备、试剂和对照以及完整和灵活的软件于一体的系统。PyroMark Q24非常适用于二、三和四等位基因突变以及连续CpG位点分析及定量，相比于Sanger测序需在测序前进行耗时的PCR产物克隆，独特的PyroMark Q24在数分钟内即可提供1-24个样品的序列分析及高度准确的定量结果。
技术特点：
(1) 流水线式流程：多功能PyroMark Q24可与表观遗传学和基因分析流程无缝结合，且与QIAGEN先进的样本制备、亚硫酸氢盐转化和PCR扩增技术相兼容；流水线式的流程意味着可更快速地获得结果。
(2) 快速简便：从PCR产物到单链样品直接用于测序，应用PyroMark Q24真空底座可在15分钟内同时制备24个样品，使用该工作站操作简单，且手动时间少于5分钟。
(3) 自动化分析：PyroMark Q24软件包含两种分析模式：CpG和 AQ（等位基因定量分析）。这两种模式可在同一个板上分析，支持同时分析不同类型的样品。AQ模式可用于分析单个和多元位点以及二、三和四等位基因突变；CpG模式可用于分析多重连续CpG位点，提供亚硫酸氢盐处理的内参。
样品要求：
1) 样品纯度：OD 260/280值应不小于1.6；260/230值不小于1.6；全基因组DNA无降解
2) 样品浓度：最低浓度不低于25ng/µl；
3) 样品总量：每个片段总量不少于500ng；
4) 样品溶剂：溶于纯水或TE中；
5) 样品运输：低温运输（-20℃）；且在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。
实验内容：
基因组DNA首先经过亚硫酸氢盐处理，序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶保持不变。亚硫酸氢盐转化完成后，根据研究目的的不同可以选择不同的DNA 甲基化检测方法，明确是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化，或是要发现全基因组中新的甲基化位点，根据客观条件筛选最灵敏、可靠、经济、简便的方法进行分析。
Pyrosequencing技术（图2-38）通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。该技术通过将链合成过程中释放出的焦磷酸（PPi（转化成光信号来监测链的合成过程。测序引物可与PCR扩增的单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶等酶以及底物，包括腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素一起孵育。与模板链互补的dNTP在DNA聚合酶的催化下结合到DNA链上，每次互补结合都会释放与dNTP摩尔量相当的焦磷酸（PPi）。存在APS的条件下ATP硫酸化酶将PPi转化为ATP，ATP可驱动荧光素酶介导的荧光素氧化，发出与ATP量成正比的可见光。荧光素酶催化反应产生的可见光可用电荷耦合器检测，可在原始数据输出中看到一个峰值（Pyrogram）。每个峰的高度（光信号）与结合的核苷酸量成正比。三磷酸腺苷双磷酸酶是一种核苷酸降解酶，可连续降解未结合的核苷酸与ATP。降解完成之后，结合另一个核苷酸。dNTP是依次添加的，反应时Alfa-硫代三磷酸脱氧腺苷（dATPS）是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。当反应继续时，形成互补的DNA链，核苷酸序列由Pyrogram的信号峰值确定。