细胞划痕实验

摘要： 在A549细胞中过表达human Oct-4-EGFP基因， 通过对Oct-4-EGFP过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组划痕宽度进行统计学分析，研究Oct-4-EGFP对细胞迁移能力的影响。实验结果显示Oct-4基因可以促进A549细胞的迁移能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
关键词：Oct-4-EGFP，划痕实验，A549

一、 实验原理
肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后比较不同实验组中肿瘤细胞迁移的能力。

二、 实验目的
用质粒Oct-4-EGFP转染后的A549细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析，考察质粒Oct-4-EGFP对A549细胞的迁移能力产生的影响。

三、 实验步骤
实验共分以下4个主要步骤：
1. 质粒转染细胞：
准备A549细胞，转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后，按照转染试剂说明书转染细胞 （8μg质粒，20μl 和元生物转染试剂）。转染24h后，重新铺盘，密度为30-40%。
2. 划线：
待细胞完全贴壁后，用200μl tip轻轻划线，垂直90度，用力均匀，确保划线处无细胞。
3. 细胞培养及拍照：
每隔3天换一次新鲜培养基。连续几天倒置显微镜下下拍照（100X），记录细胞的迁移情况，直到细胞填满划痕处。
4. 统计分析：
划线两侧间距为average gaps（AGs），使用Image-Pro Plus软件分析各组细胞的AGs。

四、 实验结果

                                                   
                                                  图1. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力的影响
  从左开始依次为A549空细胞组，NC对照组（过表达EGFP），实验组（过表达Oct-4-EGFP），每组实验均重复3次

                                               图2. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力影响的统计分析
                                                                           ***表示p<0.001

结论：从实验结果以及划痕宽度的统计分析可以发现，A549细胞在过表达Oct-4-EGFP 72h以后，迁移能力均高于空细胞组以及对照组（p<0.001）。

五、 参考文献
1. Liang CC, Park AY, Guan JL.In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.Nat Protoc. 2007;2(2):329-33.
2. Glass, M; Moller, B; Zirkel, A; Wachter, K; Huttelmaier, S; Posch, S.Cell migration analysis: Segmenting scratch assay images with level sets and support vector machines.PATTERN RECOGNITION, 2012; 45 (9): 3154.