探针合成服务
产品名称： 探针合成服务
英文名称： seeker synthesis
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更新时间： 2023-09-21T16:13:02
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核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。
一、双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation)
当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从5→3的核酸外切酶活性，能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
切口平移反应受几种因素的影响:
(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性， 故应使用仔细纯化后的DNA。
2. 随机引物合成法
随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是：
(1)Klenow片段没有5→3外切酶活性，反应稳定，可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
二、单链DNA探针
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。
单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:
(1) 以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针;
(2) 以RNA为模板， 用反转录酶合成单链cDNA探针。
1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针
合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中，以此为模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物， 在[a-32P]-dNTP的存在下，由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
2. 从RNA合成单链cDNA探针
cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: (1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA，并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3末端序列。(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子，所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多， 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后，RNA单链可被迅速地降解成小片段，经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。
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