侵袭小室实验

摘要： 在A549细胞中过表达human Oct-4基因，通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。实验结果显示Oct-4基因可以促进A549细胞的迁移能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
关键词：Oct-4，Transwell， A549，细胞迁移

一、 实验原理
Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

二、 实验目的
用质粒Oct-4-EGFP转染后的A549细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析，考察基因Oct-4对A549细胞的迁移能力产生的影响。

三、 实验步骤
实验共分以下4个主要步骤：

1. 质粒转染细胞：
准备A549细胞，转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后，按照转染试剂说明书转染细胞 （8μg质粒，20μl和元生物转染试剂）。
2. Transwell铺板：
1) 转染12h后，胰酶消化，收集细胞： 细胞计数后，每个样品准备1×106 cells/ml。
2) 1,200rpm离心5min后，重悬浮于1ml无血清培养基。
3) 湿润小室：将300μl预热的无血清培养基加入到小室中，常温放置1~2h，将ECM膜湿润。
4) 将小室中的培养基去掉，24孔板中，没有小室的孔中加入500μl含10%血清的培养基。
5) 用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中，尽量避免产生气泡。
6) 每个样品取300μl，加入到小室中，即3×105 cells加入到小室中，37℃，5% CO2培养箱中培养。
3. 细胞培养及染色：
1) 培养箱中培养72h后，取出小室。
2) 用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉。
3) 24孔板中，没有小室的孔中滴入15滴染色液（约500μl）。
4) 用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中，尽量避免产生气泡。
5) 常温放置20min，进行染色。
6) 用去离子水洗3-5次，将背景洗掉。
7) 小室内边缘残留的细胞会影响实验结果，用棉棒擦干。
4. 统计分析：
显微镜下拍照，使用Image-Pro Plus软件进行细胞计数。

四、 实验结果

                                                                               图1. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力的影响

                                      从左开始依次为A549空细胞组，NC对照组（过表达EGFP），实验组（过表达Oct-4-EGFP），每组实验均重复3次

                                                                         图2. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力影响的统计分析
                                                                                                  **表示p<0.01

结论：从实验结果以及进入小室的细胞的数量统计分析可以发现，A549细胞在过表达Oct-4-GFP 72h以后，迁移能力均高于空细胞组以及对照组（p<0.01）。

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