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细胞凋亡检测试剂盒
（In Situ Cell Apoptosis Detection Kit I，POD）
产品编号：MK1020
保存期：十二个月。-20℃冷冻保存。
工作原理
在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase ）可以将地高辛标记的dUTP （DIG-dUTP）标记至3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体（Anti-DIG-Biotin）反应后，再结合链酶亲和素-过氧化物酶（SABC），然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细包核呈黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
试剂盒内容
1. 标记缓冲液(Labeling Buffer) 1ml
2. 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20) 20μι
3. DIG-dUTP (×20) 20μι
4. 封闭液(Blocking Reagent) 4ml
5. 生物素化抗地高辛抗体(× 100) 20μι
6. SABC (× 100) 20μι
7. Proteinase K (×200) 50μι
8． 抗体稀释液 4ml
阳性对照片2张
用户自备试剂
1. 多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯
乙酸。)
3. DAB显色试剂盒（博士德公司有售)，也可自配显色剂。
操作步骤
1. 样品处理
(1) 玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。
(2) 细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛【用0.01M PBS(PH7.0---7.6)稀释的多聚甲醛】室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。
(3) 组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。
2. 新鲜配制3%H2O2，室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟×3次。
3. 标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。
4. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT
和DIG-d-UTP各1μι，加入18μι标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加
标记液，20μι/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。
5. 0.01M TBS洗2分钟×3次。
6. 加封闭液50μι/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。
7. 用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体：（取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μι），混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。
8. 用抗体稀释液1：100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC 10μι，混匀后50μι/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。
9. DAB显色：取1ml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后
加至标本片上，显色10-30分钟左右。水洗。
10. 苏木素轻度复染。0.01M TBS洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片。显微镜观察。
结果判定
细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
注意事项
1. 试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心5分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。
武汉博士德生物工程有限公司
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