产品介绍：

本试剂盒用于评估生物素标记的DNA的标记效率，所采用的方法是将标准品和待检测样品梯度点样到尼龙膜，探针结合的生物素与链霉亲和素-HRP结合，通过ECL化学发光，底片曝光或者ECL化学发光成像仪记录灰度值，亦可以使用DAB或AEC沉淀型底物，根据灰度值的比对，估算出标记样品的标记效率，标记效率低于30%为标记不合格。

本试剂盒亮点：

1. 本试剂盒操作简单，2小时可以完成标记效率测算

2. 试剂盒备齐所需的试剂组分，不需要额外准备其他的材料。

试剂盒已经提供材料：

尼龙膜（8cm*12cm）           2块

链霉亲和素-HRP（1000X）      20ul

ECL化学发光底物A            2.5ml

ECL化学发光底物B            2.5ml

Biotin-DNA Control (10nM)    200μl

实验室需要具备：

紫外交联仪（254nm）或超净工作台紫外灯，或手提式紫外检测仪（灯）；

化学发光CCD或胶片曝光暗室。

注意：如果实验室没有化学发光CCD或胶片曝光暗室可以选择生物素DNA探针标记效率检测试剂盒（DAB型）或生物素DNA探针标记效率检测试剂盒（AEC型）

其他需要自备试剂材料：

²  移液器及吸头

²  PBS(pH 7.2)

²  去离子水

试剂盒储存

链霉亲和素-HRP和Biotin-DNA Control(10nM)在-20℃储藏，其他组分4℃储藏。

试剂盒操作流程

1.   将10nM Biotin-DNA Control，用TE依次梯度稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM作为标准对照品;

2.   取2-3ul已经标记的的生物素标记DNA探针，用TE稀释成10nM待检测。取出适量的10nM生物素标记的DNA探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。

3.   取去试剂盒内尼龙膜,剪成合适大小，并做上标记，将以上步骤1和步骤2已经稀释好的标准对照品和待测的生物素标记的DNA探针依次点在膜上，每个点位点2ul;可按下表的排列顺序点膜。

4.   按照上图点样后，充分自然晾干；

5.   紫外交联仪或者紫外灯照射10分钟,距离不少于10cm,如果没有紫外灯或者交联仪直接放在超净工作台。

6.   放入1% BSA-TBST中封闭半小时；

7.   加入链霉亲和素-HRP工作液（使用前1:1000稀释），结合半小时；

8.   TBST洗涤3次，每次3分钟；

9.   取等体积ECL A组分和ECL B组分，混合后，滴加在膜上，立即胶片曝光或者化学发光成像仪记录图片。

10.  如果实验室没有化学发光成像记录仪或者胶片曝光条件，可以选用DAB底物或者AEC底物显色后。

结果判读与分析：

如果可以通过图像读取灰度数值，则可以建立Biotin-DNA Control的标准曲线，通过标准曲线计算待测Biotin-DNA探针浓度值，用计算得到的数值除以该点位DNA总量值，即可得到生物素标记效率；例如，通过标准曲线计算到待测Biotin-DNA探针第2个点的值为7.5fmol，那么7.5/10=75%,即标记效率为75%。

如果没有灰度分析仪，也可以通过肉眼观察比对估算标记效率，如：待测Biotin-DNA探针第2个点的灰度与Biotin-DNA Control的第4个点灰度值相似，则待测Biotin-DNA探针第2个点实际的生物素标记DNA探针为2.5fmol，而待测Biotin-DNA探针第2个点的总DNA量为10fmol,所以，2.5/10=25%,，通过肉眼估算得到结果比较粗糙。

注意事项：

1.   如果标记效率低于30%，用于后续检测通常是不合格的。

2.   由于TdT可以催化DNA 3'端添加多个Biotin-11-dUTP,所以有时候，很可能测算出来的标记效率数值大于100%。