转录组测序

    全转录组测序采用对读测序策略，可以获得更高的测序深度，可全面快速的获取某一条件下组织或细胞绝大部分转录本的定性和定量情况。与表达谱研究相比，全转录组测序除了可对转录本进行更加准确的定量外，还可进行更为复杂的序列分析，如新转录本和罕见转录本发现、 cSNP和 InDel鉴定、可变剪切鉴定、染色体重排鉴定、 lncRNA和UTRs鉴定等，获得更为精确完整的基因表达图谱和突破性的发现。

一、实验流程

1. 样品提取总RNA后，过柱纯化，保留200nt以上的RNA。

2. 富集mRNA，并用二价阳离子高温加热的方法将mRNA片断化。

3. 以mRNA短片段为模板，用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA。

4. 经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤，根据测序长度和是否做对读测序，确定琼脂糖凝胶电泳回收片段的大小，并进行PCR扩增，完成测序文库的制备。

5. 构建好的文库经cBot扩增，用Illumina Hiseq2500进行对读测序。 

二、数据分析

1. 无参考基因组的转录组分析（De novo Transcriptome Analysis）

1. 数据产出统计及碱基质量评估；
2. 去除低质量、污染及接头序列；
3. 对序列进行de novo组装，并对组装效果进行统计评估；
4. Unigene长度统计分析及表达丰度分析；
5. 样本间共有、特有及差异Unigene统计；
6. Unigene功能注释：(Nt、Nr、Swissprot、Interpro、GO、KEGG数据库比对)
7. Unigene差异表达及聚类分析(不少于两个样品)；
8. 差异Unigene的GO和pathway显著性富集分析。

2. 有参考基因组的转录组分析（Transcriptome analysis with reference genome）

1. 数据产出统计及质量评估
2. Reads与参考基因组序列或转录组序列比对
3. Reads在基因组上的分布统计
4. 转录本定量
5. 基因功能注释
6. 基因GO 和pathway显著性富集分析
7. 基因表达差异分析（不少于两个样品）及聚类分
8. 基因结构及变异分析：可变剪切、基因融合及cSNP鉴定等
9. 预测新基因