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【微课堂】环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢计数方法

作者:浙江泰林生物技术股份有限公司 2024-08-27T00:00 (访问量:13472)

                                      
 《药品GMP指南》生物指示剂的应用中指出,实验室在接受商品化生物指示剂时,应进行微生物数量测定。
那么,环氧乙烷灭菌生物指示剂的总芽孢数是如何确定的呢?接下来为大家分享泰林环氧乙烷灭菌生物指示剂(萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus ATCC9372)的芽孢计数方法。

环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢计数操作方法 

随机抽取需检验批次环氧乙烷灭菌生物指示剂取4片(支)放置于提前照过紫外的生物安全柜中(相关物品已放置于生物安全柜中),用酒精棉擦拭指示剂外表,通风15min以上,后续操作如下:
注意生物指示剂不要进行紫外照射,可能会造成计数结果偏低!!!
01 芽孢洗脱
在生物安全柜中,取4片(支)生物指示剂打开,取出载体,分别放置于含有3-4颗玻璃珠(直径6mm)的无菌试管中,向无菌试管中加入3mL的含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水,置于涡旋混匀仪上充分振荡,将试管中载体打散成纤维装后,再中加入7mL含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水,震荡30s,制成均一的菌悬液,将该试管记为10-1
02 热激活
将水浴锅加热至80℃-85℃,取上述试管,放置于水浴锅中热激活10min,热激完成后,立即将芽孢悬液转移至0-4℃的冰水浴中冷却至室温。
03 梯度稀释
将该试管转移至生物安全柜中,于旋涡混匀仪上旋涡30s,用移液枪吸取1mL芽孢悬液,加入到另一根含有9mL含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水的试管中,记为10-2,按照该方法依次稀释至10-3、10-4(稀释级别按制造商提供的芽孢数量而定)。
04 制备计数平皿

取芽孢数在30cfu/mL-300cfu/mL的稀释级别的试管(10-4)震荡30s,每支稀释管平行制备2个平皿,每皿加1mL菌悬液,注入15mL-20mL温度不超过45℃融化的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)。等待琼脂凝固后,倒置于30℃-35℃培养箱中培养48h-72h后计数。

05 计算

总芽孢数cfu/片(支)=平均菌落数×稀释倍数。

06 判定标准
缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeusATCC9372)的菌落圆形、凸面、粗糙、不透明,颜色呈淡黄色或淡橘色,菌落生长状态良好,单一,无杂菌。总芽孢数结果应在产品标示值的50%-300%范围内

注意事项

1、切勿将生物指示剂进行紫外照射消毒,建议对初级包装进行擦拭。

2、环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢计数,建议使用含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水进行稀释

3、吸取含纸质载体的菌液时,避免纤维堵枪头,导致移液不准确。

4、建议以单片(支)生物指示剂的形式进行计数,确保每片(支)生物指示剂计数结果均符合要求。

5、建议使用玻璃珠(4mm-6mm)对纸质载体进行打散处理。

6、芽孢计数过程中必须进行热激活处理:温度80℃-85℃,时间10min。

 

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